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Un nouveau spectromètre de masse à la plateforme Protéome

22 November 2017

Un nouveau spectromètre de masse à la plateforme ProtéomeDans le cadre du contrat de plan Etat - Région la plateforme Protéome a fait l'acquisition d'un nouveau spectromètre de masse. Il s'agit d'un Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™. Pour acquérir ce spectromètre de masse nouvelle génération, il a fallu réunir deux actions inscrites au CPER : l'action Campus B (Chimie en Aquitaine : Matériaux, Photonique, Biologie) et l'action PMUSCIVI (Plateformes MUtualisées en SCIences du VIvant) apportant respectivement 400 K€ et 600 K€. Le succès de cette opération repose sur une contribution à part égale entre l'Etat et le Conseil Régional Nouvelle Aquitaine.

L'Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ est le spectromètre de masse qui présente actuellement la plus haute sensibilité, la plus haute résolution et la plus haute précision. Par ailleurs, cet instrument présente une vitesse d’acquisition très élevée avec 20 spectres de fragmentation à la seconde. De façon atypique, ce spectromètre de masse possède trois analyseurs : un quadripôle, une trappe linéaire et un orbitrap. Ce spectromètre de masse de dernière génération est non seulement capable d’effectuer séquentiellement avec une haute fréquence trois modes de fragmentations complémentaires (CID, HCD, ETD) mais il dispose également d’un nouveau mode de fragmentation unique : l’EThcD qui permet d'augmenter la couverture des ions issus de fragmentation ETD. L’ensemble de ces caractéristiques techniques permet d’optimiser les performances de la plateforme Protéome.

Depuis son installation sur la plateforme en avril 2017, les premières expériences de qualification de l'instrument ont permis de démontrer que ce nouveau spectromètre de masse identifie plus de protéines dans des mélanges complexes (+ 50 % de peptides trypsiques identifiés), optimise la caractérisation des modifications post-traductionnelles des protéines en augmentant le taux de couverture et en utilisant des modes de fragmentation adaptés et optimise la quantification relative ou absolue des protéines.
 

La technologie HDX-MS

L'échange hydrogène / deutérium analysé par spectrométrie de masse (HDX-MS) est une approche efficace pour cartographier le repliement des protéines, les interactions protéine-ligand, les interactions protéine-protéine et les changements de conformation des protéines.

La technologie HDX-MSLorsqu’une protéine est incubée dans un solvant deutéré, certains atomes d’hydrogène peuvent s’échanger avec les deutérons du solvant. Lorsque l’échange isotopique H/D est analysé par spectrométrie de masse, seuls les hydrogènes amidiques des liaisons peptidiques sont caractérisés. La vitesse d’échange de ces hydrogènes est très variable dans une protéine structurée et va refléter l’environnement local de chaque acide aminé dans la structure tridimensionnelle. Notamment, la vitesse d’échange isotopique d’un proton amidique d’une liaison peptidique est fortement dépendante de son implication dans des liaisons hydrogènes et de son accessibilité au solvant.

Ainsi, des protons participant à des liaisons hydrogènes ou enfouis au cœur de la protéine auront des taux d’échange beaucoup plus faibles que ceux situés à la surface de la protéine.

Les échanges isotopiques sont fortement dépendants du pH. Le minimum d’échange se produit pour un pH voisin de 2-3. En dehors de cette zone de pH, la vitesse d’échange augmente d’un facteur 10 par unité de pH. C’est pour cette raison qu’il est impératif de contrôler très précisément le pH lors des expériences d’échange H/D. Les échanges H/D sont également dépendants de la température. En effet, une augmentation de la température de 10°C se traduit par une augmentation de la vitesse d’échange d’un facteur 3. La forte dépendance de la constante de vitesse des échanges vis à vis de la température et du pH, est utilisée dans les protocoles expérimentaux pour limiter au maximum le retro-échange D/H (étape de quenching de l’échange).

La technologie HDX-MSA Bordeaux, nous avons déjà réalisé des expériences d’échange isotopique H/D analysé par spectrométrie de masse notamment pour caractériser les zones d’interaction d’une sous-unité du complexe de l’ATP synthase de levure et pour caractériser le phénomène d’agrégation de la protéine prion HET-s. L’expertise ainsi acquise nous a permis d’évaluer la technologie et d’en mesurer toutes les difficultés : (i) maîtrise de l’extraction et de la purification des protéines en interaction, (ii) maîtrise de la réaction d’échange isotopique (pH, température), (iii) maîtrise du quenching (pH, température, temps d’injection au spectromètre de masse), (iv) temps d’analyse des données très long.

Avec le soutien du Conseil Régional Nouvelle Aquitaine la plateforme Protéome a acquis un automate dédié à l'HDX. Cet automate proposé par la société Leap Technologies, permet de (i) maîtriser la réaction d’échange isotopique H/D, (ii) maîtriser la réaction de quenching, (iii) optimiser l'analyse des résultats. En collaboration étroite avec la société CovalX, la plateforme Protéome a optimisé l'approche HDX-MS en s'appuyant sur cet automate. Aujourd'hui l'approche HDX-MS peut être proposée à la communauté scientifique. Pour toutes informations complémentaires prendre contact avec Stéphane Chaignepain  (stephane.chaignepain@u-bordeaux.fr).